Các bạn sắp tới sẽ hoặc đang làm việc với virus DNA như HBV, CMV. HPV, BKV, EBV...? Các bạn đang sử dụng kit tách chiết của 1 hãng nào đó (Qiagen, Roche, Thermo...)? Các bạn đang gặp vấn đề tách chiết mẫu khó thậm chí đã sử dụng kit của Qiagen? Dưới đây là một số kinh nghiệm chia sẻ để tiến hành công việc thuận lợi. Show B1. Bổ sung 20 uL Protease (hoặc proteinase K) vào mỗi ống epp 1.5 mL B2. Bổ sung 200 uL mẫu (máu tổng số, huyết thanh, dịch chiết, buffy coat…) vào ống ở bước (1) và vortex B3. Bổ sung 200 uL Buffer AL. Vortex 15s (Lưu ý không cho Protease/Proteinase K trực tiếp vào AL) B4. Ủ 56oC/10 phút, lắc đều dung dịch trong quá trình ủ. Spin down cho dung dịch lắng hết xuống đáy, không dính trên nắp B5. Bổ sung 200 uL EtOH 100% vào mẫu. Invert 15s. Spin down B6. Lên cột. Ly tâm 8000 rpm/phút trong 1 phút. Loại dịch chảy qua cột, chuyển cột sang 1 ống thu mới (được cấp bởi kit) B7. Cho 500 uL Buffer AW1. Ly tâm 8000 rpm/phút trong 1 phút. Loại dịch chảy qua cột, thay ống thu (được cấp bởi kit) B8. Cho 500 uL Buffer AW2. Ly tâm 14000 rpm/ phút trong 3 phút B9. Chuyển cột ly tâm sang ống thu mới. Ly tâm khan tốc độ tối đa (14,000 rpm) trong 1 phút B10. Chuyển cột sang ống 1.5ml sạch. thêm 50 - 200 uL Buffer AE. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 8000 rpm/phút trong 2 phút. Các bước (3), (5), (10) là các bước cần chú ý và được hãng khuyến cáo với một số thay đổi (thể hiện trong handbook). 2. Quy trình tách viral DNA khuyến cáo - Sử dụng quy trình Blood or Body Fluid ở trên với một số thay đổi sau: - Luôn sử dụng carrier RNA (5-10 ug/200 ul AL) trong Bước 1 quy trình để tăng tối đa hiệu quả gắn DNA của virus lên cột. Việc sử dụng Carrier RNA rất quan trọng đặc biệt với các mẫu nồng độ virus nhỏ hơn 10000 copies/ml. Khi bổ sung Carrier RNA cần tuân thủ đúng hướng dẫn của hãng để đạt hiệu quả. - Bước 5, tăng thể tích EtOH từ 200 lên 230 uL để việc gắn DNA lên cột được tối ưu. - Nếu sử dụng Internal Control DNA (IC) để kiểm tra quá trình tách chiết DNA và sự hiện diện của chất ức chế thì cần lưu ý chiều dài của IC phải lớn hơn hoặc bằng 200bp. Vì kit tách QIAamp DNA Blood Mini Kit và DNA Mini Kit chỉ có thể tách được sản phẩm từ 200bp - 40kb. Đặc biệt IC không được cho trực tiếp vào mẫu mà phải bổ sung sau khi add AL. - Nếu cần thiết có thể cô đặc mẫu bằng màng lọc Amicon® Centricon-100 (Millipore, 2 ml), Microsep 100 (Filtron, 3.5 ml), and UltraFree® CL (Millipore, 2 ml) hoặc các hãng khác tương đương. - Tại bước Elution có thể elute 60 ul, tuy nhiên để đạt hiệu quả tốt đa thì nên elute 2 lần mỗi lần 50 ul với đệm AE của bộ kit. Lưu ý nhỏ dung dịch vào giữa màng để màng được thấm đều, nếu không sẽ không thu được sản phẩm. 3. Một số thông tin cơ bản về kit QIAamp DNA Blood Mini Kit và DNA Mini Kit Thông tin chi tiết về kit QIAamp DNA Blood Mini Kit và QIAamp DNA Mini Kit tham khảo ở bài viết http://chienbio.blogspot.com/2015/07/lua-chon-kit-tach-chiet-dnarna-hang.html Nguồn: Blog Chienbio 14:46, 05/04/2013 Đây là nội dung được quy định tại Thông tư 13/2013/TT-BTNMT của Bộ Tài nguyên và Môi trường quy định quy trình kỹ thuật và định mức kinh tế - kỹ thuật trong phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng Axit deoxyribonucleic, ban hành ngày 31/3/2014.
Phương pháp tách chiết ADN đối với động vật, thực vật và vi sinh vật (Ảnh minh họa) Cụ thể, tại Phụ lục quy trình kỹ thuật phân tích định tính, định lượng Axit Deoxyribonucleic ban hành kèm theo Thông tư 13/2013/TT-BTNMT quy định phương pháp tách chiết ADN đối với động vật, thực vật và vi sinh vật được áp dụng theo các phương pháp khác nhau, cụ thể: * Phương pháp chiết ADN các mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa trên CTAB: Phương pháp này sử dụng để chiết ADN từ thực vật và các loại chất nền có nguồn gốc từ thực vật, do có khả năng loại bỏ các hợp chất polysacarit và polyphenol vốn có ảnh hưởng đến chất lượng ADN. Phương pháp này cũng có thể dùng cho các loại chất nền khác. Các bước tiến hành cơ bản:
* Phương pháp chiết ADN từ các mẫu sinh học có nguồn gốc từ động vật dựa trên phenol/ chloroform: Phương pháp này có thể dùng để chiết ADN ra khỏi các loại chất nền khác nhau. Phenol thường rất thích hợp để biến tính các protein và phá hủy các enzyme nucleaza. Các bước tiến hành cơ bản:
* Phương pháp chiết ADN đối với các mẫu sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật dựa trên phenol/chloroform: Phương pháp này mô tả qui trình chiết và tinh sạch ADN đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR từ nấm men hoặc nấm sợi, hoặc các quần thể vi khuẩn được phân lập. Phương pháp này cũng thích hợp đối với việc truy nguyên ADN từ các sinh vật biến đổi gen trong các loại chất nền phức hợp cao. Việc phân lập vi khuẩn ra khỏi chất nền, nuôi cấy vi khuẩn tăng thu sinh khối tế bào, sau đó tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn phân lập sẽ cho kết quả tin cậy nhất. Các bước tiến hành cơ bản:
Chi tiết xem thêm Thông tư 13/2013/TT-BTNMT, có hiệu lực từ 05/8/2013. Lê Vy
Cách đây ít ngày, HappyVet có chia sẻ về quy trình tách chiết DNA, bài viết này chúng ta sẽ tiếp tục đi tìm hiểu về phương pháp tách chiết RNA tổng số và mRNA để mọi người cùng hiểu và ứng dụng vào thí nghiệm phân tử, di truyền, sinh học một cách tốt nhất. Phương pháp tách chiết RNAKỹ thuật tách chiết RNA là một trong những quy trình phức tạp với nhiều phương pháp, thủ thuật khác nhau. Mặc dù vậy nhưng kết quả thu được đảm bảo được chất lượng cao và sử dụng được nhiều kỹ thuật phân tích. Để thu nhận được RNA tinh sạch, bạn cần phải loại bỏ hoàn toàn những thành phần tạp chất, nhất là protein. Tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau trong hai pha không hòa tan.  Hình ảnh minh họa RNA => Lưu ý: RNA là một phân tử kém bền nên việc thao tác tách chiết cần được thực hiện trong những điều kiện nghiêm ngặt trong tủ cấy vô trùng, cần đeo gang tay khi thực hiện. Quy trình tách chiết RNA tổng sốCũng giống với DNA, RNA được tiến hành tách chiết theo các bước cơ bản bao gồm: Phá vỡ màng tế bào, loại bỏ protein và tủa RNA. Quy trình tách chiết được diễn ra như sau: - Biến tính protein bằng việc nghiền tế bào với chất tẩy rửa SDS, sarcocyl nồng độ cao, nitơ lỏng. Đồng thời, mẫu cũng được nghiền với chất khử 2-mercaptoethanol nhằm ức chế RNase. Nước sử dụng trong quá trình tách chiết cũng cần được xử lý bằng DEPC (Diethylpyrocarbonat) để loại bỏ RNase. - Các protein, DNA được loại bỏ qua xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi Trizol, sau đó ly tâm ta tách được RNA trong pha nước. DNA ở độ pH - 4 sẽ bị hấp thụ vào pha dưới cùng với Phenol, protein sẽ biến tính và nằm giữa hai pha sẽ bị loại bỏ cùng DNA và Phenol. - Lúc này, RNA trong pha nước sẽ được hút ra sau đỏ tủa bằng izopropanol để -20°C, tiến hành ly tâm và rửa lại bằng ethalnol 79%. Cuối cùng, thu hồi RNA tinh khiết và bảo quản lạnh ở -70oC để làm thí nghiệm tiếp theo. Quy trình tách chiết ARN tổng số Quy trình tách chiết RNA khác nhauTùy vào kích thước trọng lượng phân tử mà bạn có thể tiến hành sắc kí, điện di hoặc ly tâm để tách từng loại RNA khác nhau. Kỹ thuật tách chiết RNA được diễn ra như sau: mRNA có đuôi polyA nên bạn tiến hành tác RNA ra khỏi mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực oligodt-xenlulose. Bạn có thể sử dụng viên bi từ, trên bề mặt có gắn oligodt sẽ liên kết với mRNA và giúp chúng bám trên bề mặt bi. Lúc này, các viên bi sẽ thu nhận và đem ly tâm ra thu được mRNA tinh khiết. => Lưu ý: Để tách RNA khác nhau, bạn đi từ tế bào biệt hóa, lượng mRNA nhiều và đây cũng là con đường nghiên cứu cấu trúc gen mã hóa. Kit tách chiết RNANhững phương pháp tách chiết trên có tính ứng dụng cao tuy nhiên quy trình làm thủ công, tốn thời gian và tốn công sức và khó tự động hóa. Chính vì thế mà các bộ kit ra đời để tối ưu những nhược điểm trên. Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng kit ly trích axit nucleic taco ™ trong phương pháp tách chiết RNA. Ưu điểm của bộ kit này là mẫu nhỏ nhưng thu được sản phẩm RNA là rất lớn. Kit được thiết kế đặc biệt để sử dụng với hệ thống ly trích axit nucleic tự động taco ™, dễ dàng sử dụng. Đây là công cụ thuận tiện, nhanh chóng và tách chiết RNA tổng số từ các mẫu, loại bỏ các chất ức chế, thu được RNA tinh sạch phục vụ cho các quá trình nghiên cứu. Bộ kit tách chiết DNA/ RNA Hiện tại, các loại kit tách chiết DNA/ RNA đang được HappyVet phân phối trên thị trường, đáp ứng được các nhu cầu sử dụng trong phòng thí nghiệm phân tích, sinh học, y học,... Khi mua sản phẩm tại đây, bạn sẽ được chuyên gia sinh học tư vấn chi tiết về công dụng, cách sử dụng của từng dòng sản phẩm. Ngoài các bộ kit tách chiết, HappyVet còn cung cấp thêm các loại kit iiPCR Pockit, kit Real time PCR,.... phục vụ công tác chẩn đoán bệnh trên thú y, thủy sản và nghiên cứu. Vừa rồi là những kiến thức tổng quan về phương pháp tách chiết RNA mà HappyVet chia sẻ để bạn đọc tham khảo. Nếu bạn đang có nhu cầu tìm hiểu và sử dụng Kit tách chiết DNA/ RNA hãy liên hệ ngay số HOTLINE 0983.600.953 để được tư vấn và báo giá chi tiết. => XEM THÊM => Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Tìm kiếm liên quan: - Phương pháp tinh sạch dna - Ứng dụng của tách chiết and |
