ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOAKHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־GIÁO TRÌNHTHÍ NGHIỆM KỸ THUẬT SINHHỌC PHÂN TỬNgười soạn: Ths.PHẠM THỊ KIM THẢOĐà Nẵng, 2016NỘI DUNG THỰC HÀNHBài 1: Tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩnBài 2: Một số phương pháp định tính và định lượng DNA thôBài 3: Thiết lập phản ứng PCRBài 4: Tách chiết plasmidKế hoạch thí nghiệm (5 buổi)YÊU CẦU THÍ NGHIỆMSinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệmKẾ HOẠCH THÍ NGHIỆMBuổi 1Kiểm traLàm quen với các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong sinh học phân tử, Chuẩn bị hóachất, môi trường, nuôi cấy vi khuẩnBuổi 2 (Bài 1)Kiểm traTiến hành tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩnBuổi 3: (Bài 1 phần còn lại và Bài 2)Nhận xét buổi làm thứ 2, và thực hành bài số 2Buổi 4:Làm bài 3 (thiết lập phản ứng PCR) và bài 4YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNGTHÍ NGHIỆM SHPT1. Quy tắc làm việc trong phóng thí nghiệm-Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp và vệ sinh phòng thí nghiệm-Mỗi người mỗi nhóm có nơi làm việc riêng, chỉ sử dụng những dụng cự thiết bịdành riêng cho mình. Thiếu thì phải hỏi cán bộ hướng dẫn. Tuyệt đối không lấy củangười khác.-Trong phòng thí nghiệm không được ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… luôn mặc áoBlue khi làm việc-Không được tự điều chỉnh hoặc sử dụng những thiết bị của phòng thí nghiệm khichưa được hướng dẫn.-Sau khi thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm và sắp xếp gọngàng nơi làm việc-Trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay bằng xà phòng diệt khuẩn. Trườnghợp cần thiết phải sát trùng bằng cồnTiến hành ghi chép thí nghiệm:Trong sổ phải ghi chép đầy đủ các điều có liên quan đến việc hoàn thành các thínghiệm. Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng và theo một trật tự nhất định.Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu và ngày kết thúc.2/ Đối tượng nghiên cứu3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm4/ Nguyên tắc cơ bản của phương pháp phân tích đã sử dụng5/Kết quả nhận được.Các số liệu phải ghi thành từng bảng. Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hìnhvẽ, ghi chép tất cả các số liệu thực nghiệm và các tính toán vào trong sổ.CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỪ1. Micropipettes đơn kênh (Pipetman)Đặc điểm cấu tạo :Hình 1.1: Cấu tạo pipet, cách cầm pipetman (micropipet) và các tip tương ứng.- Đặc điểm phân loại:Dựa vào thể tích lấy mẫu người ta chia micropipet thành 6 loại:Bảng 1.1: Các loại pipetman và thể tích tương ứngSTT123456Loại pipetP-2P-10P-20P-100P-200P-1000Giới hạn sử dụng (l)0.1-20.5-102-2010-10050-200100-1000Độ chia nhỏ nhất(l)0.0020.020.20.20.22.0Bảng 1.1: Ví dụ sử dụng pipetman mix theo thể tíchChú ý:- Cắm đúng loại tip của từng pipet (tương ứng với thể tích cần hút)- Không dốc ngược pipetman khi đang hút hóa chất- Không được chỉnh quá giới hạn thể tích qui định trên thân pipet- Cuối buổi thí nghiệm phải điều chỉnh pipet về trạng thái nghỉ (giá trị lớn nhất hoặcnhỏ nhất )BÀI 1: TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO VI KHUẨNNguyên tắc chung: Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thunhận một lượng acid nucleic đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Yêu cầucủa kĩ thuật tách chiết acid nucleic là thu nhận được phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đakhông bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Các acid nucleic cần được tách chiết trongđiều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase, Rnase).Qui trình tách chiết acid nucleic (DNA, RNA) thường gồm 3 bước chính sau:1. Phá bỏ màng tế bào và (màng nhân)Có thể phá bỏ màng tế bào và (màng nhân)bằng phương pháp hóa học, vật lí hoặc cơ học.Đối với phương pháp hóa học, thường sử dụng các chất tẩy như SDS (Sodium dodecyl sulfat),Triton X 100 với nồng độ thích hợp. Đối với phương pháp vật lí, người ta thường sử dụng sóngsiêu âm để phá vỡ màng tế bào. Đối với các mẫu mô thực vật, động vật, trước tiên cần sử dụngphương pháp cơ học như xay, nghiền trong nitơ lỏng để thu nhận các tế bào đơn..2. Loại bỏ proteinĐể thu nhận acid nucleic (DNA, RNA) cần phải loại bỏ các thành phần không mong muốntrong mẫu, chủ yếu là protein. Ở đây thường dùng hỗn hợp gồm phenol, chloroform vàisoamylalcohol theo tỉ lệ thể tích 25:24:1. Phenol có tác dụng làm biến tính protein và không hòatan nucleic acid. Chloroform cũng có tác dụng làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loạibỏ hoàn toàn phenol ra khỏi phần dung dịch có chứa DNA. Isoamylalcohol giúp ổn định giữa haipha nước và pha chloroform.Trong các phương tách chiết DNA thì phương pháp sử dụng phenol: chloroform là phươngpháp cơ bản. Ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80 °C) nhưng khi lẫn vớikhoảng 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa với các phântử nước vây quanh. Khi pha hỗn hợp này vào dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kị nước nêncó khuynh hướng liên kết vào vùng kị nước của protein ở bên trong cấu trúc của các phân tử này,kết quả làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị nước (của gốc amino acid) ra ngoài.Các nhóm kị nước này của protein khi đó kết hợp với nhau tạo thành kết tủa gồm nhiều phân tửprotein khác nhau. Trong khi đó DNA vẫn tiếp tục là chất tan trong nước, dựa vào tính chất này cóthể phân tách DNA và protein nhờ vào kĩ thuật li tâm.3. Tủa nucleic acidMục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảovệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịchtheo các nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông thường là:- Tủa trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồngđộ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 thể tích ethanol:1 thể tích mẫu), nhiệt độthấp thuận lợi cho việc tủa.- Tủa trong isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiệndiện của muối, thể tích isopropanol: thể tích mẫu = 0,8-1Thực hành tách chiết DNA từ mẫu vi khuẩnA. VẬT LIỆUDịch tế bào vi khuẩn bacillus subtilicB. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ- Micropipet đơn kênh loại 1000 µl, 200 µl- Pipet thủy tinh- Eppendorf loại 1,5 ml- Máy li tâm lạnh- Máy vortex (lắc rung)C. HÓA CHẤT- Dung dịch TE 10X+ Tris pH 8.0 100mM+ EDTA 50mM- Dung dịch NaCl 0,5 M- Dung dịch Phenol:Chloroform (1:1)- Dung dịch Chloroform- Dung dịch Ethanol tuyệt đối- Dung dịch Ethanol 70%D. CÁCH TIẾN HÀNH- Hút 1,5 ml dịch tế bào vi khuẩn cho vào eppendorf. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút.Thu cặn tủa.- Hòa cặn tủa trong 500 µl dung dịch TE 1X, bổ sung thêm 50 µl NaCl 0,5 M và 50 µl SDS10 %. Huyền phù nhẹ nhàng. Ủ hỗn hợp ở 650C trong 10 phút. Chuyển hỗn hợp sang ủ trên đátrong 5 phút.- Thêm một thể tích dung dịch phenol:chloroform vào hỗn hợp trên. Lắc mạnh bằng vortextrong 30 giây.- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C. Thu lấy phần dịch phía trên (là pha nướccó chứa DNA), nhẹ nhàng chuyển sang một eppenforf khác.- Thêm một thể tích dung dịch chloroform, Lắc mạnh bằng vortex trong 30 giây.- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C. Thu lấy phần dịch phía trên (là pha nướccó chứa DNA), nhẹ nhàng chuyển sang một eppenforf khác.- Thêm 50 µl dung dịch NaCl 0,5M. Bổ sung 2-2,5 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh (hoặc0,8-1 thể tích isopropanol). Ủ ở -200C trong 1-2 giờ.- Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 30 phút, ở 40C. Thu cặn tủa.- Thêm 500 µl dung dịch ethanol 70% để rửa tủa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút, ở04 C. Thu cặn tủa. Để khô.- Hòa tủa trong dung dịch TE 1X, bảo quản dịch DNA ở -200C.Yêu cầu: SV nắm được nguyên tắc và ý nghĩa của các bước trong qui trình tách chiết DNA.Câu hỏi: Nêu mục đích của các bước trong qui trình tách chiết DNA được sử dụng trong bài thựchành.BÀI 2: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀĐỊNH LƯỢNG THÔ DNASau khi thu nhận DNA ở dạng sạch, người ta có thể tiến hành phân tích định tính và địnhlượng chúng bằng một số phương pháp như đo mật độ quang, điện di, sắc kí…Trong bài thực hànhnày, chúng ta tiến hành định lượng bằng quang phổ kế và điện di để kiểm tra độ tinh sạch cũngnhư xác định hàm lượng DNA đã thu nhận được trong bài 1.2.1. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế.Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid (DNA, RNA) cótrong mẫu. Nguyên tắc của phương pháp này như sau: đối với nucleic acid, do sự tương tác giữacác proton và các electron của vòng purine và pyrimine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ởbước sóng 260 nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230 nm-240 nm vàkhông hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310 nm. Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xácđịnh được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm. Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion. Độ hấp thụtăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm.Nồng độ acid nucleic trong mẫu được xác định dựa vào tương quan như sau:Một đơn vị OD 260nm tương ứng với một nồng độ là:- 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi- 40 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đơn hoặc RNA- 20 µg/ml cho một dung dịch oligonucleotide.Khi tính toán nồng độ dung dịch acid nucleic cần chú ý độ pha loãng của dung dịch. Cáchtính này chỉ đúng với các dung dịch acid nucleic sạch.Trong mẫu acid nucleic thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm tăng độhấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid đượcđánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm. Được tính bằngcông thức sau:Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch acid nucleic được xem là tinh sạch (khôngtạp nhiễm protein)❖ Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect)Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm của DNA tăng lên khi DNA biến tính tứclà hai sợi đơn tách rời khỏi nhau. DNA không bền đối với nhiệt. Khi tăng nhiệt độ của DNA lênquá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi sẽ tách ra do sự phá vỡ của các liên kết Hidro.Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng không có khả năng bắtcặp lại khi làm lạnh đột ngột sau khi biến tính.Thực hành xác định nồng độ dung dịch DNAA. Vật liệuDung dịch DNA thu được ở bài 1B. Dụng cụ - thiết bị- Micropipet đơn kênh loại 1000 µl, 200 µl- Cuvet thủy tinh- Eppendorf loại 1,5 ml- Máy đo quang phổ UV-VISC. Hóa chất- Dung dịch TE 1X (để pha loãng mẫu)D. Cách tiến hànhXác định độ tinh sạch và nồng độ dung dịch DNA- Hút 20 µl dung dịch DNA, hòa trong 80 µl dung dịch TE 1X- Tiến hành đo giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD 260) và 280 nm.- Ghi nhận kết quả, tính nồng độ ban đầu của dung dịch DNA.Quan sát hiện tượng siêu sắc.- Lấy toàn bộ dung dịch DNA ở trên cho vào một eppendorf sạch. Đun ở 100 0C trong 10phút rồi nhanh chóng làm lạnh trên đá trong 5 phút.- Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch DNA vừa biến tính ở bước sóng 260 nm (OD260 *)- So sánh giá trị OD 260 ban đầu và OD 260 của dung dịch DNA sau biến tính.2.2. Phương pháp điện diPhương pháp này được sử dụng trong phân tích định tính và trong việc thu nhận mẫu acidnucleic.Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic. Đó là cácđại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động một điện trường, chúngsẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của các phân tử acid nucleic phụ thuộcvào hai yếu tố chính: khối lượng phân tử và nồng độ các chất thành gel. Ngoài ra, cấu hình củaphân tử cũng ảnh hưởng đến khả năng di động.Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu acid nucleic là gel polyacrylamide và gelagarose. Việc lựa chọn gel cũng như nồng độ của chất cấu thành gel phụ thuộc vào kích thướctrung bình của các đoạn acid nucleic cần phân tách.Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tiến hành điện di trên gel agarose. Đây là loại gelthông dụng nhất, thao tác đơn giản, có thể phân tách được những đoạn có kích thước trong khoảng0,1-20kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằmngang.Quá trình điện di thường sử dụng một số dung dịch điện li như Tris-acetate-EDTA (TAE),Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,57,8. Các dung dịch này không những thiết lập một giá trị pH thích hợp để bảo vệ cấu trúc acidnucleic trong quá trình điện di, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho quá trình dẫn điện(conductivity).Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được quan sát dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một chất cótên là Ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của các acidnucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang (màu đỏ cam). Trong bài thực hànhnày, EtBr sẽ được cho vào gel trước khi đổ.Ngoài ra, để ước lượng kích thước của các trình tự acid nucleic trong gel agarose, người tasử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử “, Đó là tập hợp nhiều trình tự DNA có kíchthước đã biết trước (gọi là thang DNA).Thực hành điện di mẫu DNA thu đượcA. Vật liệuDung dịch DNA thu được ở bài 1Thang DNAB. Hóa chất – dụng cụ - thiết bịAgarose 1%Dung dịch điện di TBE 1XDung dịch tải mẫuDung dịch Ethidiume bromide 10mg/mlBộ điện di nằm ngangBộ đổ gelC. Cách tiến hành❖ Chuẩn bị gel agarose 1%Trong bài thực hành này, chúng ta tiến hành điện di trên gel agarose 1 % và sử dụng dungdịch điện di TBECân 1g agarose, bổ sung 100 ml dung dịch TBE. Đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Đểnguội và bổ sung 2 µl dung dịch EtBr 10 mg/ml. Tiến hành lắp lược và đổ gel vào khuôn như hìnhvẽ.Chú ý: Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến. Vì thế, luôn đeo găng tay khi thao tác.-Lấy 20 µl dung dịch DNA, hòa trong 5 µl dung dịch tải mẫu 5X. Trộn đều.-Tiến hành nạp mẫu vào giếng như hình vẽ-Điện di trong 30 phút, ở hiệu điện thế 90-120 V-Quan sát kết quả dưới ánh sáng tử ngoại.Yêu cầu: Sinh viên tính toán nồng độ dung dịch DNA tách chiết được ở bài 1, đồng thời ghi nhậnlại kết quả điện di. Nhận xét.Trường hợp mẫu DNA không tinh sạch thì cách xử lí như thế nào?BÀI 3: THIẾT LẬP PHẢN ỨNG PCR( POLYMERASE CHAIN REACTION)Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờenzyme polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 là một kỹ thuật được sử dụngphổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại. PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài mồi (primer)nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị luânnhiệt (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Hình 3.1).Hình 3.1. Máy PCR của Hãng Bio-Rad.3.1. Nguyên tắc của PCRTất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đềucần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặpbổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành các mạchmới. Phương pháp PCR được hình thành dựa vào các đặc tính của các DNA polymerase. Taqpolymerase là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermusaquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có bốn loạideoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai mồi (mồi xuôi và mồi ngược), trên cơsở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mớihình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên đượcnhân lên gấp nhiều lần. Mồi xuôi (forward primer, ký hiệu là F) sẽ bắt cặp đặc hiệu trên mạchDNA 3’→5’. Mồi ngược (reverse primer, ký hiệu là R) sẽ bắt cặp đặc hiệu trên mạch DNA 5’→3’.Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:- Biến tính (denaturation)Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợiđơn (single strands). Quá trình biến tính được thực hiện ở nhiệt độ ở 94-95oC trong vòng 30 giây 1 phút.- Bắt cặp mồi (annealing)Trong giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắtcặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng ở 40-65oC, tùy thuộc vàoTm của mồi sử dụng.- Kéo dài (extension)Giai đoạn này, nhiệt độ được tăng lên đến 70-72oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taqpolymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có mồi theo chiều 5’→3’. Thời gian kéodài tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần nhân bản.Hình 3.2. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase (PCR).Hình 3.3. Các chu kỳ của kỹ thuật khuếch đại PCR.Một chu kì gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đôi sốlượng bản sao của lần trước.Thực hành khuếch đại gen mã hóa enzyme cellulose của vi khuẩn bacillussubtilic bằng PCRA. Vật liệuDNA bản mẫu tách chiết ở bài 1B. Hóa chất – Dụng cụ - Thiết bịMồi xuôi và mồi ngược: mỗi mồi nồng độ 10 pmol/μl.Enzyme Taq polymerase (Fermentas) và dung dịch đệmdNTP (gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP)Dung dịch MgCl2Nước cất 2 lần đã hấp khử trùngCác hóa chất dùng cho Điện di (kiểm tra sản phẩm)Eppendorf dùng cho phản ứng PCRMáy luân nhiệt PCR (Bio-Rad)Hệ thống điện di nằm ngangC. Cách tiến hànhTrong bài thực hành này, chúng ta sẽ tiến hành nhân bản gen từ DNA bộ gen bacillussubtilic thu nhận được trong bài 1. Gen có kích thước khoảng 750 bpMỗi nhóm tiến hành thiết lập một phản ứng PCR (thể tích V= 25 µl) như sau:Nước cất 2 lần11,5 µlDung dịch đệm2,5 µlMgCl25 µldNTP2,5 µlDịch DNA1 µlMồi xuôi1 µlMồi ngược1 µlTaq polymerase0,5 µl+Chu kì nhiệt950C - trong 5 phút950C - trong 1 phút550C - trong 30 giây720C - trong 1 phút720C - trong 5 phút30 chu kìĐiện di kiểm tra sản phẩm sau phản ứng PCR-Điện di trên gel Agarose (1 %)Tiến hành tương tự như bài 2.Yêu cầu: Mỗi nhóm dựa vào kết quả điện di, xác định kích thước sản phẩm PCR của nhóm. Vẽ lạikết quả điện di. Nhận xét kết quả.BÀI 4: TÁCH CHIẾT PLASMIDHiện tại, có 3 phương pháp chính thường được dùng để tách DNA plasmid ra khỏi vi khuẩn(thường là E. coli):-Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm-Phương pháp đun sôi-Phương pháp dùng LithiumViệc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào điều kiện thí nghiệm và mục đích nghiên cứu.Trong thực nghiệm thì cả 3 phương pháp trên đều cho hàm lượng và chất lượng DNA tốt, đảm bảocho các thí nghiệm tiếp theo.Cả 3 phương pháp đều liên quan đến việc thu nhận DNA plasmid mạch vòng từ hỗn hợp lẫn tạpvới DNA genome mạch thẳng.Việc xử lý hoặc là bằng base hay bằng chất tẩy đều với mục đích là phá huỷ mối liên kết giữacác cặp base (của DNA) làm cho DNA genome mặch thẳng bị biến tính và dễ dàng loại bỏ bằng lytâm. Trong khi đó, vì DNA plasmid ở dạng siêu xoắn (supercoiled configuration) có đặc điểm làdễ dàng phục hồi lại hình dạng ban đầu dưới điều kiện hồi tính.1- Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm (alkaline lysis)Vi khuẩn bị dung giải (lysis) khi xử lý với dung dịch chứa SDS (sodium dodecyl sulfate) vàNaOH. Trong đó, SDS sẽ làm biến tính protein – phá vỡ màng tế bào và NaOH (nằm trong Sol II)sẽ làm biến tính DNA genome và DNA plasmid. Sau đó, hỗn hợp được trung hoà bằng potassiumacetate (CH3COOK) (nằm trong Sol III). Khi dung dịch đã được dung hoà thì DNA plasmid vòngsẽ được hồi tính nhanh chóng và hoà tan vào trong dung dịch. Ngược lại, DNA genome và cácprotein khác bị kết tủa và “vướng” vào trong phức hợp SDS-kali, sau đó được loại bỏ bằng ly tâm.Chú ý: Phản ứng cắt enzyme sẽ không tốt khi DNA bị lẫn NaOH/SDS hay là kali acetate, do đócần phải rửa tủa cẩn thận bằng cồn 70%.2- Phương pháp đun sôi (boiling)Vi khuẩn có chứa DNA plasmid được phá vỡ bằng lysozyme, Triton-X100 (một chất tẩy phi ion –nonionic detergent) và nhiệt độ. DNA genome sẽ vẫn bám vào màng tế bào vi khuẩn và được loạibỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, DNA plasmid được giải phóng và hoà tan vào trong dung dịch vàđược thu nhận bằng cách tủa với alcohol.Chú ý: Phương pháp này nhanh nhưng chất lượng DNA thấp hơn so với phương pháp thuỷ phânbằng kiềm.3- Phương pháp dựa vào LithiumKhi xử lý với hỗn hợp Triton X-100/LiCl thì chỉ có màng trong (inner plasma membrane) của tếbào vi khuẩn sẽ bị phân huỷ. Do đó, ở phương pháp này vẫn giữ được hình dạng của tế bào (vìmàng ngoài không bị phá huỷ), và tất nhiên là DNA plasmid vẫn còn bị giữ lại trong tế bào. Nhưngsau khi bổ sung phenol/chloroform vào làm biến tính và kết tủa các protein nội bào. Đồng thời tếbào sẽ co lại nhanh chóng và đẩy dung dịch nội bào (bao gồm cả DNA plasmid) ra ngoài, trong khiđó thì DNA genome và protein sẽ bị giữ lại trong sinh khối tế bào và được loại bỏ bằng ly tâm.Bảo quản DNA plasmid- Bảo quản Plasmid trong tế bào:Plasmid có thể được bảo quản thời gian ngắn (khoảng 1 tháng) khi tồn tại trong tế bào vi khuẩn vàđược cất ở 40C.Nếu muốn bảo quản tế bào chứa plasmid lâu hơn thì nên bổ sung 1V glycerol hoặc DMSO vàđông lạnh ở -70°C.- Bảo quản DNA plasmid: DNA plasmid có thể được bảo quản trong đệm TE ở 4°C trongmột vài tuần. Nếu ở -20°C thì được vài năm.Thực hành tách chiết palamid vi khuẩn EcoliA.Vật liệu- Tế bào Ecoli Bl21B.Hóa chất – Dụng cụ - Thiết bị+ TE-RNAnase :10mM Tris-HClpH = 81mM EDTA100µg/ml RNAnase100µl RNAnase (10mg/ml) vào 10ml TE (10:1)- được 100µg/ml RNAnase+ SolI (solution I) : 50mM tris – HCl (pH=8)10mM EDTAKhử trùng????+ Sol II:NaOH 200mMSDS 1%+ Sol III: KAC (potassium acetate CH3COOK ) 3M pH = 5,5Các hóa chất dùng cho Điện di (kiểm tra sản phẩm)EppendorfHệ thống điện di nằm ngangC.Cách tiến hành- Hút 1,5 ml dịch tế bào vi khuẩn cho vào eppendorf. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút.Thu cặn tủa.- Hòa cặn tủa trong 150 µl dung dịch SolI, Lắc mạnh bằng vortex- Thêm 150 µl dung dịch SolII, lắc nhẹ- Thêm 150 µl dung dịch SolIII, đảo nhẹ.- Thêm 450 µl chloroform:isoamylalcohol (24:1), đảo vài lần.- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, ở 40C. Thu lấy 400 µl phần dịch phía trên (là phanước có chứa DNA plasmid), nhẹ nhàng chuyển sang một eppenforf khác.- Thêm 40 µl (tỉ lệ 1:10) dung dịch NaOAC 3M và 1 ml Etanol 100%, lắc đảo vài lần.(hoặc thêm 500µl isopropanol không NaOAC).Ủ ở -200C trong 2 giờ (hoặc -85 trong 30 phút)- Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 20 phút, ở 40C. Thu cặn tủa.- Thêm 500 µl dung dịch ethanol 70% để rửa tủa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, ở04 C. Thu cặn tủa. Để khô trong box (hoặc trong speedVac).- Thêm 40 µl TE-ARN-nase, ủ 37°C từ 1-2h, bảo quản -20°CTÀI LIỆU THAM KHẢOTài liệu tham khảo chính:[1] Nguyễn Hoàng Lộc, Giáo trình “Công nghệ AND tái tổ hợp”, 2005 , NXB DDHQGTP Hồ Chí Minh.[2] Nguyễn Thị Lang, Sinh học phân tử- giới thiệu phương pháp và ứng dụng, NXBNông nghiệp 2005Tham khảo thêm:[3]. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục 2008.[4]. Hồ Huỳnh Thùy Dương và cộng sự, Thực tập Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc GiaTPHCM.[5]. E-book, Current Protocol in Molecular Biology[6]. Jonh Wiley & Sons, Current protocols in molecular Biology, 2003. |
